ЛЕКЦИИ ПО ЭНЗИМОЛОГИИ

Лекция 1. Принципы про...
   1. Уровни организац...
   2. Механизмы формир...
   3. Внутриклеточная ...
Лекция 2. Домены. Акти...
   1. Домены и формиро...
   2. Активный центр.
   3. Фермент-субстрат...
   4. Прочность компле...
Лекция 3. Причины уско...
   1. Причины ускорени...
   2. Использование эн...
Лекция 4. Молекулярные...
   1. Гидрофобное взаи...
   2. Электростатическ...
   3. Стабилизация пер...
Лекция 5. Механизм сбл...
   1. Механизм сближен...
   2. Оценка свободной...
   3. Структурные и те...
Лекция 6. Механизмы н...
   1. Теория индуциров...
   2. Концепции деформ...
   3. Полифункциональн...
   4. Механизм действи...
   5. Заключение.
Лекция 7. Специфичност...
Лекция 8. Регуляция фе...
   1. Типы регуляции. ...
   2. Диссоциативная р...
   3. Адсорбционная ре...
   4. Регуляция ковале...
   5. Регуляция ограни...
Лекция 9. Аллостеричес...
   1. Механизмы аллост...
   2. Количественный а...
Лекция 10. Диссоциатив...
   1. Типы структур, о...
   2. Характер распред...
   3. Влияние специфич...
   4. Скорость установ...
   5. Динамическая мик...
Лекция 11. Адсорбционн...
   1. Физиологическая ...
   2. Адсорбционный ме...
   3. Физиологические ...
   4. Сборка мультифер...

Лекция 7. Специфичность и структура белка (2 часа).

В этой лекции мы обсудим вопросы, касающиеся эффективности и специфичности ферментативного катализа.

В схеме Михаэлиса-Ментен

реакция (7.1)

скорость реакции

v = kkat[ES] (7.2)

реакция (7.3)

реакция (7.4)

Подставив (7.4) в (7.2), получим, что скорость реакции можно выразить как

реакция (7.5)

Аналогичное выражение можно вывести для модели, в которой вместо константы диссоциации KS используется константа Михаэлиса KM. В том и другом случае отношение kkat/KM представляет собой кажущуюся константу скорости второго порядка. Из этого уравнения можно сделать важные выводы.

1. Если за фермент конкурируют два субстрата А и В, то получим

реакция (7.6)

Отсюда следует, что специфичность, т. е. выбор ферментом только одного из двух конкурирующих субстратов, определяется отношением kkat/KM.

2. Увеличение скорости ферментативных реакций происходит при увеличении отношения kkat/KM за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстрата, а также при увеличении концентрации свободного фермента за счет повышения КМ.

Для эволюции ферментов характерно увеличение КМ с последующим увеличением kkat. Скорость изменения этих параметров быстро уменьшается по мере увеличения КМ до значений, больших [S]. При КМ = [S] половина фермента находится в свободном состоянии, поэтому и скорость реакции равна половине максимальной. При КМ = 5[S] в свободном состоянии находится 5/6 молекул фермента, и скорость реакции равна 83% максимальной. Любое дальнейшее увеличение даст лишь незначительное увеличение скорости.

Насколько сильно возрастет КМ - зависит от структурного различия между субстратом и его переходным состоянием. В пределе любое увеличение КМ должно компенсироваться ослаблением связывания переходного состояния. Наиболее сложен этот процесс для крупных метаболитов, присутствующих в высокой концентрации.

Центральную проблему специфичности можно сформулировать так: каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого?

Так, сериновые протеазы гидролизуют полипептид только после определенных аминокислот: химотрипсин - после ароматических, трипсин - после положительно заряженных, эластаза - только после самых маленьких. Этот эффект (опознавание субстрата по принципу «ключ- замок») достигается четкой структурой той специфической части субстрат-связывающего "кармана", куда должна улечься последняя (как на трипсине) или предпоследняя (как на папаине) перед точкой щепления боковая группа пептида. Специфичность α-химотрипсина определяется объемным гидрофобным радикалом в молекуле субстрата (типа боковой группы фен, трп), а для эластазы - метильной группой ала. Механизм наблюдаемой специфичности обусловлен весьма незначительными различиями в строении активных центров этих двух ферментов. По данным рентгено-структурного анализа α-химотрипсин имеет довольно вместительный "гидрофобный карман", где связывается ароматическая боковая группа гидролизуемого пептида (рис. 7.1, слева)

Рис.7.1.  Субстрат-связывающий карман в разных сериновых протеазах: Первый слева - α-химотрипсин ; второй - трипсин; третий - эластаза.

Рис.7.1. Субстрат-связывающий карман в разных сериновых протеазах: Первый слева - α-химотрипсин ; второй - трипсин; третий - эластаза.

В активном центре эластазы размеры сорбционной области, где происходит связывание метильной группы субстрата, намного меньше. Это вызвано тем, что два глицина (216 и 226), расположенные у входа в карман α-химотрипсина, в случае эластазы замещены более объемными валином (216) и треонином (226) (рис.7.1, справа). Если сравнить субстрат-связывающий центр α-химотрипсина с трипсином, то заметим, что размеры и форма сорбционного участка в активных центрах обоих ферментов примерно одинаковы. Единственное различие в первичной структуре полипептидных фрагментов, образующих гидрофобный карман, состоит в том, что в α-химотрипсине остаток 189 - сер, а в трипсине в соответствующем положении находится отрицательно заряженная асп. Это приводит к тому, что в отличие от α-химотрипсина трипсин обнаруживает специфичность к гидролизу пептидных связей, образованных положительно заряженными аминокислотами (лиз, арг). Сорбция положительно заряженного субстрата на ферменте (вблизи каталитически активного нуклеофила активного центра) происходит в данном случае за счет электростатических взаимодействий.

Однако протеазы еще могут позволить себе изредка ошибаться в выборе точки щепления. Но есть белки, от которых требуется колоссальная точность работы. Это, например, аминоацил-тРНК синтетазы, от точности работы которых зависит точность синтеза белков. Поэтому они не могут позволить себе ошибаться чаще, чем однажды на много тысяч синтезов аминоацил-тРНК, тогда как опознавание аминокислоты специфическим субстрат-связывающим карманом допускает порядка 1% ошибок. Для устранения этих ошибок используется эффект "двойного сита" (рис. 7.2). Этот эффект обеспечивается специальной конструкцией фермента.

Рис.7.2. Схема "двойного сита" для механизма редактирования работы изолейцил-тРНК синтетазы

Рис.7.2. Схема "двойного сита" для механизма редактирования работы изолейцил-тРНК синтетазы

У фермента аминоацил-тРНК синтетазы два активных центра: центр синтеза и центр гидролиза. Причем гидролиз аминоацил-тРНК на аминоацил-тРНК синтетазе не есть просто реакция, в точности обратная синтезу: обе эти реакции идут с выделением свободных фосфатов, т.е. обе - с понижением свободной энергии. При этом субстрат-связывающий карман центра гидролиза меньше, чем карман центра синтеза аминоацил-тРНК. Принцип сита - не пропускать частицы, большие, чем ячейки сита. На первом сите при синтезе аминоацил-тРНК, тРНК заряжается "правильной" аминокислотой и некоторым числом "неправильных", более мелких (более крупные аминокислоты отвергаются все, а большая часть "неправильных" мелких все же отвергается по причине различий в гидрофобности/ гидрофильности, но отбор по гидрофобности/ гидрофильности не столь жесток, как отбор по возможности втиснуться в карман данного размера). Итак, на выходе этапа синтеза, много аминоацил-тРНК с "правильной" аминокислотой и некоторое количество аминоацил-тРНК с "неправильными" аминокислотами.

На втором активном центре, на втором "сите", субстрат-связывающий карман которого поменьше, идет гидролиз образовавшихся аминоацил-тРНК, - но только тех, где аминокислота меньше, чем "правильная". То есть "правильная" аминокислота отвергается карманом гидролизного центра, этим "вторым ситом", а все остальные аминоацил-тРНК гидролизуются и распадаются. В сумме, два эти сита и обеспечивают выход только "правильно заряженных" аминоацил-тРНК.

В завершение рассказа о специфичности ферментов, стоит остановиться на двух прагматических аспектах. Во-первых, сейчас масса людей занята изучением субстрат-связывающих карманов и подбором - с открытыми глазами, не на ощупь - связывающихся с ними ингибиторов. Особый интерес, по понятным причинам, вызывают протеазы и другие белки вируса СПИДа. Во-вторых, большое применение находят точечные мутации в районе активного (и прежде всего субстрат-связывающего) центра: они позволяют модифицировать "природную" субстратную специфичность (например, менять специфичность сериновых протеаз) и даже создавать новые, искусственные специфичности для нужд промышленности и медицины. Значительный интерес также вызывают попытки - пока это лишь попытки - создания (на "твердом фундаменте" белковой глобулы) "нового" активного центра, - с новой, "привитой" функцией, - путем направленных точечных замен аминокислотных остатков исходного белка.

Изучение ферментативной деятельности белка показывает, что в нее вовлечена совсем небольшая часть белковой глобулы, в то время как остальная ее часть служит лишь как бы твердым каркасом, обеспечивающим "правильное" строение закрепленного на нем активного центра. Поэтому нас не должно удивлять, что белки с совсем разной первичной структурой, и даже с совсем разной и пространственной структурой могут иметь одинаковые или очень сходные биохимические функции. Классическим примером снова являются сериновые протеазы. Есть два класса таких протеаз - типа трипсина и типа субтилизина. Они совсем не похожи ни по аминокислотной последовательности, ни по общей форме (рис.7.3), и даже принадлежат к разным структурным классам (трипсин - двухдоменный β-белок, субтилизин - однодоменный α/β-белок).

Рис.7.3

Рис.7.3. Схема строения сериновых протеаз типа трипсина (а) и субтилизина (б). На фоне общего контура глобул показаны α-спирали, β-листы и β-цилиндры. Район активного центра показан черным треугольником.

Они имеют одинаковую конфигурацию лишь ключевых аминокислотных остатков в каталитическом центре (рис.7.4), причем не всех остатков целиком, а лишь их функционально-важных "кончиков" - но не имеют одинаковой конфигурации остатков даже в субстрат-связывающем кармане.

Рис.7.4.

Рис.7.4. Схема строения каталитических центров сериновых протеаз типа трипсина (а) и субтилизина (б). Черным выделены фрагменты главной цепи (вплоть до Сβ-атомов); направление хода цепи в этих фрагментах показано стрелками. Кружком показано место оксианионовой дыры. Видно, что только расположение концов боковых групп каталитической триады переноса заряда (Ser, His, Asp) и - с натяжкой - положение оксианионовой дыры инвариантно в этих двух классах сериновых протеаз, в то время как кардинальные отличия наблюдаются даже в ходе главной цепи у ключевых каталитических остатков His и Asp.

Более того: существуют протеазы, совершенно не похожие на сериновые протеазы даже в зоне каталитического центра, в частности, металлопротеазы типа карбоксипептидазы или термолизина. У них ключевую роль в катализе играет плотно встроенный в белок ион Zn++ (рис. 4.1, 4.2). Имея маленькие радиусы, многозарядные металлические ионы создают вокруг себя очень сильное электрическое поле. Это позволяет им в металлопротеазах активировать молекулу воды (отщепляя от нее Н+) с тем, чтобы та осуществила бы далее разрыв пептидной связи, и одновременно стабилизировать зарядом Zn++ отрицательный заряд на тетраэдрическом переходном состоянии разрываемого пептида.

Итак, одна и та же химическая реакция может осуществляться совсем разными белками. При этом одну и ту же ключевую роль - роль мощных электрических резаков - в одних белках играют многозарядные металлические ионы, в других - легко принимающие электроны или протоны органические кофакторы, в третьих - активированные своим окружением (как в трипсине) боковые группы...

С другой стороны, разные белки с одной и той же формой укладки цепи могут катализировать совершенно разные реакции. Все это показывает довольно широкую независимость общего строения белка от его ферментативной активности.

    В этой лекции использованы текст и рисунки из литературы:

  1. Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов. - М.: Мир, 1980. - 432 с.
  2. Финкельштейн А. В., Птицын О. Б. Физика белка: Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями. - М.: Книжный дом "Университет", 2002.-376 с.

Факультет медицинской биотехнологии УдГУ
© 2003 Кожевникова О.В.

Powered by swift.engine
© 2003 MITTEC